一 样品处理

1. 样品来源：石油污染土壤样品（2020.12.18）

2. 样品标记与形貌：

表1-1 石油污染土壤样品信息（注：样品总量均约1.5g）

图1-1 石油污染土壤样品形貌

3. 样品接收与封存：2021.07.11.10:00接收样品，于4℃冰箱保存

4. 样品开启处理：2021.07.14.23:00开启样品，在冰箱低温环境下，使用酒精灭菌药匙于倾斜的原瓶中盛出固体样品，迅速转移至无菌塑封袋中，使用塑封膜封好原样品瓶。每一瓶样品取样两次，分为好氧菌组和厌氧菌组。取样过程中需要保证无外来污染，每取一次样药匙需要使用75%酒精或酒精棉进行消毒处理并完全干燥。好氧菌组用药匙将受污染样品的外表面轻轻剐蹭下部分，密封好塑封袋，厌氧菌组始终保持袋内密封。使用研钵锤按压粉碎六个样品至粉末状。先进行好氧菌组的培养，预先将厌氧菌组放置到厌氧培养箱中除氧。

5. 样品取样培养：好氧菌组于2021.07.14.23:30开始培养。使用药匙取用土壤粉末中心部位的土壤约0.5g（质量根据体积近似提前进行分析天平的称量），三个样品之间质量差异不大。厌氧菌组于2021.07.14.23:50开始培养。具体操作同上。

6. 其他。剩余原样品以及取用样品组全部保存于冰箱中；冰箱温度显示为5℃。

二 母液富集

1. 培养方法的筛选：取用0.5g石油污染土壤样品，接入装有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，加入石油原油0.5%质量，封口置于摇床中自然光照下震荡培养两天（30℃，120r/min）[1]。厌氧菌的培养在厌氧瓶中，严格厌氧并在30℃下静置避光培养。因为样品量较少，取用样品量为0.5%，且直接投放进富集培养基中富集，考虑到菌种数量可能较少，浓度较低，没有使用PBS/0.9%NaCl均匀分散成泥浆。

2. 好氧菌组富集培养基的配置：为挑选出具有石油降解性能的油田污染石油降解菌，以石油为细菌培养基的唯一碳源，而无机盐培养基MSM即专为特定碳源降解实验而设计，能够分离具有石油降解性能的细菌。此次实验好氧菌组使用的培养基配方如下：

表1-2 好氧菌组无机盐培养基MSMⅠ配方[2]

注：将以上试剂溶于1L蒸馏水中，完全溶解后，调节pH为7.5

表1-3 维生素混合物配方

注：将以上试剂溶于250mL蒸馏水中，完全溶解后，于4℃低温密封保存

表1-4 微量元素混合物配方

注：将以上试剂溶于1L蒸馏水中，完全溶解后，调节pH为7.0

     富集培养基配好后，封口于高压蒸汽灭菌锅中121℃高温蒸汽灭菌30mins，后置于冰箱中4℃冷藏待用。使用时，向其中加入0.5%质量的灭菌石油原油，以除菌94号汽油作为对照。使用过程中避免杂菌污染，及时封口。

3. 厌氧菌组富集培养基的配置：

      同样使用无机盐培养基MSMⅡ，但厌氧菌的生长对于基础盐组分的消耗与好氧菌不同，两培养基组分有所差异。

表1-5 厌氧菌组无机盐培养基MSMⅡ配方[3]

注：将以上试剂溶于1L蒸馏水中，完全溶解后，调节pH为7.0

4. 培养使用材料：

（1）MSM：无机盐基础培养基，加入特定碳源后用于研究细菌对于碳源的降解能力，或用来分离具有独立降解能力的细菌；对于细菌的冻干粉，应该先使用加富培养基如NA、TSA等复苏后进行MSM培养。（配置具体的配方和取样土壤/水体的盐度有关系，以及是否添加微量元素，还有添加石油烃的含量也需要具体考虑）

（2）石油原油：实验用培养基内碳源为石油原油，取自原油油井，黑色粘稠油状液体，挥发性强，有刺鼻性气味。由于较大的粘滞性，难以通过砂芯漏斗和0.22μm孔径滤膜，故使用紫外灯照射杀菌。使用注射器向锥形瓶中滴加石油约0.5g（质量根据体积近似提前进行分析天平的称量），混匀锥形瓶；

4. 厌氧富集：

（1）厌氧培养基制备：将配置好的MSMⅡ培养基50mL加入到提前洗净烘干的三个厌氧瓶中，贴上标签后，向其中通入N220min，并加入1mL0.04g/mL的半胱氨酸溶液，加塞密封后置于高压蒸汽灭菌锅中除氧灭菌。取出后置于厌氧培养箱中冷却至室温，打开瓶塞后向其中加入约0.3g的灭菌石油。考虑到刃天青指示剂的细菌毒害作用，则体系内不加入指示剂；

（2）厌氧菌富集：在厌氧培养箱中，用药匙取用样品中心土壤粉末，装入厌氧瓶中，重新加塞密封后，充分震荡。操作全过程在厌氧环境下操作，台面、手套、药匙使用酒精棉球消毒，避免杂菌感染。将接种好样品的厌氧瓶拿出置于恒温培养箱中30℃下培养。

（3）厌氧菌长势中期观察：培养七天后，使用1mL无菌注射器取用三个厌氧瓶中的菌液，梯度稀释3倍，吸取10μL菌液于载玻片上制片，在相差显微镜20*100放大倍数下观察，发现视野当中，10μL的菌液中，活菌的数量较少，整个视野中出现约20个单菌，呈金黄色圆球状，如下图。

图1-2 厌氧石油降解菌显微图片

      考虑到厌氧菌的生长比较缓慢，且石油烃中含有对细菌生长有毒害作用的组分，对于厌氧菌组继续培养，至今培养时间已至一个月。后期继续进行细菌密度的观察。

三 分离纯化

1. 厌氧菌的分离纯化：菌种的计数除了直接法的光学显微镜计数板计数之外，也可以通过间接法稀释涂布平板的单菌落进行计数[4]。实验对厌氧菌组进行稀释涂布平板，以观察菌的生长状况。对于厌氧菌组的分离纯化，所使用的固体培养基为MSMⅢ无机盐培养基，配方如下：

表1-6 厌氧菌分离培养基MSMⅢ配方

注：将以上试剂溶于1L蒸馏水中，完全溶解后，调节pH为7.0

      将以上1L培养基分别倒出50mL至三个厌氧瓶中，加入1.8%质量的琼脂粉，即0.9g，后三瓶培养基分别通入N220min，加塞密封后置于高压蒸汽灭菌锅中除氧灭菌。待灭菌结束后立即放入厌氧箱中进行倒平板，根据梯度稀释原则每一瓶菌液稀释10-5、10-7、10-9三个梯度，使用石油和柴油两种碳源，即共需要倒板的数量为18个，根据培养皿平板的数量确定所灭菌/除菌的碳源剂量、涂布棒和离心管等材料的使用量。

      稀释所用1.5mL离心管和枪头均提前高温灭菌，经烘箱干燥后使用。碳源石油的处理方法除了好氧菌培养组的操作之外，还需要保证注射器内无空气气泡，且针头保护效果好，在抽真空过程中可以抽出石油内残留气体，也可以避免使石油被真空抽吸溅洒。碳源汽油使用市面94号汽油，为澄清透明淡黄色液体，强挥发性，刺鼻性烃味。使用注射器吸取少量汽油，并通过0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌。进入厌氧箱操作同石油。

      提前用酒精棉球消毒，倒板之后待冷却后向其上滴加3d石油/汽油碳源，均匀抹平后倒置避免杂菌污染，使用1mL注射器吸取0.1mL菌液注入固体培养基上，用一次性涂布棒涂布均匀后，使用稀释涂布-叠皿夹层法，及时向上倒上固体培养基覆盖层，造成厌氧环境。所有组在原固体培养基冷却硬化前操作完毕。将操作好后的固体平板标记清楚，倒放于厌氧袋中，加入除氧袋后密封拿出厌氧培养箱，于30℃下避光静置培养。操作过程中严格控制厌氧，培养五天后观察，结果所有组均并未发现固体培养基上长有明显菌落。猜测为菌液中菌数量极少，或者在固体培养基上难以存活，被碳源杀死。遂对原富集菌液继续培养，而后续的分离纯化工作则全部针对好氧菌。

2. 好氧菌组的分离纯化：好氧菌组培养基的浑浊程度比较高，即好氧菌能够在石油为碳源的环境下大量繁殖。在培养时间1d以后液体富集培养基明显浑浊，即石油污染土壤样品中的好氧菌富集成功。后期分离纯化需要进程的操作为固体平板涂布，挑取单菌落至液体培养基中放大培养，后蘸取液体菌液于固体培养基上划线分离，后持续两次，至划线平板上生长出单菌落。分离所使用的固体培养基为LB培养基，主要成分为胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠，以及1.8%的琼脂粉。按照液体培养基放大：固体纯化=1d:2d的时间比例，在9天的时间内持续纯化分离，并时刻观察培养皿中细菌菌落的生长情况，其中，液体培养基使用MSM培养基灭菌之后，加入定量的灭菌石油原油，固体平板的制备在前一次和最后一次使用石油/汽油直接涂布在冷却后的固体平板上，考虑到石油/汽油涂布后的平板表层，是油性疏水的，因此在加入菌液后，比较难以将菌液均匀分散在石油平板上，会造成涂布不均匀的情况出现，因此中间一次实验将灭菌石油原油直接加入到灭菌后的固体培养基胶体中，待未凝固前将体系混合均匀，使得石油能够均匀分散在固体培养基中后再进行倒板。在制板的过程中，发现平板在凝固过程中，石油有成滴聚集的趋势，造成细菌不能好的利用碳源，遂放弃这种方法。

      涂布方法为：在无菌操作台中，提前打开紫外灯照射杀菌并通风，后关灯点燃酒精灯，在酒精灯前的三角无菌区进行倒板，注意倾斜盛装培养基的容器，将培养皿微微开口，待培养皿中固体培养基凝固之后，将板翻过来至水分蒸发。使用灭菌离心管对原菌液进行稀释至10-5倍，后使用无菌移液枪枪头吸取稀释后的菌液100μL放入培养皿平板上，使用灭菌涂布棒进行均匀涂布，后继续倒置平板，消杀涂布棒。将均匀涂布好的培养基倒置放于无菌袋中，30℃静置培养。挑单菌落方法为：用高温灭菌后放凉的接种环蘸取单菌落，将其接种到液体培养基中，加入石油原油，在30℃，120rpm的摇床中日光培养。平板划线方法：用接种环蘸取培养后的菌液，按照如下图划线方法对石油平板进行划线培养。最终分离出好氧组单菌落三株，菌株的来源与特征标记如下表。          表1-7 好氧菌单菌株来源与特征标记（注：分离时间为2021.07.22）

图1-3 石油好氧菌单菌株平板与显微镜像（a:HD-1单菌平板；b:HD-2单菌平板；c:HD-3单菌平板；d:HD-1显微镜像；e:HD-2显微镜像；f:HD-3显微镜像）

四 菌种鉴定

1. 菌液制备：

     挑取以上制备的单菌落平板上的单菌落，至液体培养基MSM（含灭菌石油原油）中，培养1d，全程避免杂菌感染，在无菌操作台中将培养好的菌液转移至灭菌的离心管中，送检测定菌种。

2. 16s rRNA菌种鉴定结果：

     使用通用引物进行16s rRNA测序鉴定，通用引物全长1465bp（名称为27F/1492R），测定结果分析如表：

表1-8 菌种16S rRNA测试分析对比结果

      以HD-2样品组分离出来的菌株为后期目标实验菌株，HD-2对比检测结果：

3.  菌种基本生理信息简介。

     Acinetobacter spp.细菌在自然界广泛存在，可以在潮湿和干燥的表面生存，是重要的土壤微生物，并可在水体中聚集存在，是海洋环境中的优势菌。大多数不动杆菌属细菌可以在寡营养培养基中生长，菌落一般为圆形光滑，直径2mm左右，无色，少数菌株菌落为淡黄色或灰色。不动杆菌属细菌可耐受的pH 范围为 3.0−9.0，生长温度范围为 20−40 °C， 最适 pH 为 6.0−7.0，最适生长温度约为30°C。

      不动杆菌属细菌具有代谢多样性，可以降解己内酰胺、除草剂、有机磷农药和多种石油烃组分等。石油烃中含量最高的组分是饱和烃(烷烃和环烷烃)和芳香烃，不动杆菌属细菌对三者的降解效率为烷烃>环烷烃>芳香烃。不动杆菌通过氧化酶将石油烃氧化成小分子物质，或彻底氧化分解成CO2和水，在这个过程中获得能量进行代谢。

图1-4 不动杆菌属细菌降解烷烃的两种主要途径

不动杆菌属细菌降解烷烃的两种主要途径如图1-4所示。

五 扩大培养

1. 培养基使用：MSM无机营养盐培养基，初始pH=7.20

2. 富集筛选和纯化方法：取好氧菌培养的母液，使用接种环蘸取少量菌液加入到700mL含有15d石油原油（为避免石油含量过高而多环芳烃等有毒物质对细菌的毒害）的MSM培养基中，在30℃、120rpm条件下摇床培养，第一阶段培养30天，后每隔7d将菌液更换到新的含有石油的MSM培养基中继续培养，连续培养28d后取100μL培养液进行涂布[5]。为防止细菌生长过于密集阻碍分离出单菌落，根据每个样品中细菌数量和活性的不同分别稀释10-5、10-7、10-9三个梯度，来确定最佳稀释倍数。随后按照最佳稀释倍数稀释后，涂布到LB固体培养基上。将涂布完成的培养皿放入30℃环境中培养。每隔12h观察一次，将新长出的单菌落挑出进行三区划线，划线步骤要多次进行直至在培养基上形成有一种菌株形成的单菌落为止。

3. 将原菌液进行扩大培养，培养30d后进行以上分离纯化操作，目前观测到原液中的细菌种类至少有五种，后期进行继续分离纯化。

参考文献

[1] 汪杰, 郑维爽, 礼晓, 等. 高效石油降解菌的筛选鉴定及修复能力研究[J]. 环境科学学报, 2010, 30(06):1228-1234.

[2] Tian, X., Wang, X., Peng, S., Wang, Z., & Zhou, R. (2018). Isolation, screening, and crude oil degradation characteristics of hydrocarbons-degrading bacteria for treatment of oily wastewater. Water Science and Technology, 78(12), 2626-2638. doi:http://dx.doi.org/10.2166/wst.2019.025

[3] 吴伟林. 石油烃厌氧降解菌的筛选及其降解特性研究[D]. 中国石油大学, 2011.

[4] 周德庆. 微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2011：152.

[5] 张永坤. 石油烃降解菌的筛选与多样性分析[D]. 山东大学, 2019.

[6] 刘玉华, 王慧, 胡晓珂. 不动杆菌属(Acinetobacter)细菌降解石油烃的研究进展[J]. 微生物学通报, 2016, 43(07):1579-1589.